Yale School of Medicine araştırmacıları, yaşayan insan akciğer dokusundan RNA elde etmeyi kolaylaştıran iki yöntem geliştirerek precision-cut lung slices çalışmalarındaki en önemli teknik engellerden birini azalttı.
Canlı akciğer dokusunu laboratuvarda inceleme imkânı
Precision-cut lung slices, yani hassas kesilmiş akciğer dilimleri, araştırmacıların insan akciğer dokusunu beden dışında canlı halde incelemesine olanak tanıyor. Bu örnekler, organı oluşturan farklı hücre tiplerini ve yapıları koruduğu için, hücrelerin nasıl etkileştiği ve deneysel uygulamalara nasıl yanıt verdiği görülebiliyor.
Bu yöntemin önemli bir avantajı da aynı kişiden birden fazla örnek alınabilmesi. Böylece araştırmacılar, aynı donörden gelen dokular üzerinde karşılaştırmalı deneyler yapabiliyor ve yanıtları daha güvenilir biçimde değerlendirebiliyor.
Yale School of Medicine’deki Pulmonary, Critical Care and Sleep Medicine bölümünde araştırma asistanı olan ve çalışmanın ilk yazarı Reina Rangel, dokuda birden fazla hücre tipinin bulunmasının, hücrelerin birbirleriyle nasıl iletişim kurduğunu anlamak açısından çok değerli olduğunu belirtiyor. Rangel’e göre PCLS, bu tür etkileşimleri incelemek için güçlü bir model sunuyor.
Agaroz RNA çıkarımını zorlaştırıyordu
PCLS üretmek için bağışlanan insan akciğerleri agaroz ile şişiriliyor. Jel benzeri bu madde, normalde yumuşak ve gözenekli olan dokuyu ince dilimler halinde kesmeye yetecek yapısal desteği sağlıyor. Ancak aynı madde, örneklerden gen ifadesini anlamada kullanılan RNA’nın çıkarılmasını güçleştirebiliyor.
Araştırma ekibi, geride kalan agarozun RNA çıkarma sürecine müdahale ettiğini gösterdi. Geleneksel yöntemle yapılan çıkarımda elde edilen RNA miktarı, çalışmada saptama eşiğinin altında kaldı ve RNA bütünlüğü de ekibin denediği iki alternatif yönteme göre belirgin biçimde daha düşüktü.
Rangel, sorunu agarozun biyolojik kökenini düşünerek ele aldığını aktarıyor. Agaroz deniz yosunundan elde edilen bir polisakkarit olduğu için, bitki dokularındaki karmaşık karbonhidratlar için geliştirilmiş RNA çıkarma araçlarının akciğer örneklerinde işe yarayıp yaramayacağını değerlendirdi.
İki farklı yaklaşım daha iyi sonuç verdi
Rangel bu sırada, RNA’yı çıkarmadan önce agarozu uzaklaştıracak bir yol arayan kıdemli araştırma bilimci Joan Marti-Munoz, PhD ile aynı problem üzerinde çalıştı. Marti-Munoz, elektroforezde nükleik asitleri saflaştırmak için sık kullanılan agaroz çözücü bir tampon uyguladı.
İkinci yaklaşımda ise bitki bazlı RNA çıkarma kiti kullanıldı. İki yöntem de RNA geri kazanımını artırdı; ancak agarozun çözülmesine dayanan yöntem, en yüksek RNA verimini ve bütünlüğünü sağladı.
Marti-Munoz, PCLS içindeki agarozu RNA çıkarımından önce eritmeye yönelik bir çözüm aradığını ve elektroforezde rutin kullanılan bir tamponun bu iş için iyi sonuç verdiğini söylüyor.
Daha güvenilir RNA, daha sağlam deney planı
Ekip için en önemli kazanımlardan biri güvenilirlik oldu. Daha önce araştırmacılar RNA analizi için birkaç akciğer dilimi ayırsa da, çıkarımın başarısız olması nedeniyle bazı örnekleri kaybedebiliyordu. Yeni yöntemle, deney planı yapılırken istenen örnek sayısının gerçekten elde edilmesi mümkün hale geldi.
Rangel, eskiden RNA çıkarımı için ayrılan beş örneğin tamamının bazen sonuç vermediğini, şimdi ise beş örnek planlandığında gerçekten beş RNA örneği alınabildiğini söylüyor. Bu da deney tasarımını daha öngörülebilir hale getiriyor.
Daha sağlam ve bozulmamış RNA, PCLS örneklerinde RNA dizilemesi gibi ileri analizlerin yapılabilmesini sağlıyor. Bu sayede aynı insan donöründen alınan dokuların farklı deneysel tedavilere nasıl yanıt verdiği karşılaştırılabiliyor.
Pulmoner fibrozis araştırmalarına da katkı sağlayabilir
Çalışma, özellikle pulmoner fibrozis araştırmaları açısından önem taşıyor. Akciğerde skarlaşmaya yol açan bu hastalıkta, olası tedavilerin beklenen etkiyi gösterip göstermediği gen ifadesi değişimleri üzerinden değerlendirilebiliyor.
Marti-Munoz, yüksek kaliteli RNA elde etmenin anlamlı gen ifadesi çalışmaları için kritik olduğunu ve geliştirdikleri yöntemin bu hedefe ulaşmaya yardımcı olduğunu ifade ediyor. Rangel ise insan dokusunun ilaç geliştirme çalışmalarında değerli olduğunu, çünkü tasarlanan ilaçların insanlarda işe yaramasının hedeflendiğini vurguluyor.
Çalışmanın diğer Yale yazarları arasında Sabina Anderson, Giuseppe Deluliis, Edward Manning, Farida Ahangari ve Naftali Kaminski yer alıyor. Pulmonary, Critical Care and Sleep Medicine, Yale Department of Internal Medicine bünyesindeki 10 bölümden biri olarak belirtiliyor.
